MÉTODOS DE ESTUDIO EN MICROBIOLOGÍA: TINCIONES

Las muestras clínicas y las suspensiones de microorganismos se pueden colocar sobre un portaobjetos de vidrio y se pueden explorar con el microscopio (es decir, estudio directo de una preparación en fresco). Aunque con este método se pueden ver microorganismos grandes (p. ej., elementos fúngicos y parásitos) y material celular, a menudo es difícil el análisis de estructuras internas. La microscopia con contraste de fases puede superar algunos de estos problemas; además, de manera alternativa, una muestra o un microorganismo se pueden teñir con diferentes métodos.

Estudio directo

Los métodos de estudio directo son los más sencillos para preparar muestras para el estudio microscópico. La muestra se puede suspender en agua o suero salino (preparación en fresco), mezclada con un álcali para disolver el material de fondo (método de hidróxido potásico [KOH]) o mezclada con una combinación de un álcali y un colorante para generar contraste (p. ej. azul de algodón lactofenol, yodo). El colorante tiñe de manera inespecífica el material celular, lo que aumenta el contraste con el fondo y permite el estudio de las estructuras detalladas. Una variación es el método de tinta china (colorante nigrosina), en el que la tinta oscurece el fondo y no la célula. Este método se utiliza para detectar cápsulas alrededor de microorganismos, como la levadura Cryptococcus (el colorante queda excluido por la cápsula, lo que crea un halo claro alrededor de la célula) y la bacteria encapsulada Bacillus anthracis.

Tinción: aumento del contraste en el microscopio de campo claro

Se pueden usar colorantes para teñir las células y mejorar el contraste, de modo que sea más fácil observarlas al microscopio de campo claro. Los colorantes son compuestos orgánicos, y cada clase de colorante tiene una afinidad por materiales celulares concretos. Los colorantes sufren combinación química con el protoplasma de la bacteria; de modo que si la célula no está muerta, el proceso de tinción la destruye; por tanto, tal proceso es drástico y puede producir artefactos. Muchos de los  colorantes usados en microbiología tienen carga positiva (cationes teñidos con un anión incoloro), y por esta razón reciben el nombre de colorantes básicos. Ejemplos de ellos son el (cloruro de) azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Los colorantes básicos se unen fuertemente a los componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos (carga negativa en los fosfatos) y los polisacáridos ácidos. Como las superficies celulares suelen estar cargadas negativamente, estos colorantes también tienen gran afinidad por dichas superficies, de modo que son muy útiles para un estudio general. Otros colorantes tienen carga negativa y se denominan colorantes ácidos (p. ej., eosinato– de sodio+). Los colorantes ácidos no tiñen a las células bacterianas y por tanto pueden utilizarse para teñir el material de fondo a fin de proporcionar un contraste de color.

Para realizar una tinción simple se toma una preparación de células previamente secadas. Sobre un portaobjetos de vidrio limpio con la suspensión de células secadas se vierte una solución diluida de un colorante básico y se deja durante uno o dos minutos, se enjuaga varias veces con agua y se seca.

Como las células son tan pequeñas, las preparaciones secadas y teñidas de Bacteria y Archaea se suelen observar con una lente de inmersión en aceite muy potente.

Los colorantes básicos tiñen las células bacterianas de manera uniforme a menos que en primer lugar se destruya el RNA citoplásmico. Sin embargo, pueden utilizarse técnicas de tinción especial para diferenciar los flagelos, cápsulas, paredes celulares, membranas celulares, gránulos, nucleoides y esporas.

Tinciones diferenciales: Las tinciones que tiñen de colores diferentes tipos distintos de células se llaman tinciones diferenciales. Se utilizan diversas tinciones diferenciales para teñir microorganismos específicos o componentes del material celular. La tinción de Gram es la tinción mejor conocida y más utilizada, y forma la base de la clasificación fenotípica de las bacterias (dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativas). Las levaduras también se pueden teñir con este método (las levaduras son grampositivas). Las tinciones de hematoxilina férrica y tricrómica son sumamente útiles para la identificación de parásitos protozoarios, y la tinción de Wright-Giemsa se utiliza para identificar parásitos sanguíneos y otros microorganismos seleccionados. Las tinciones como la metenamina de plata y el azul de toluidina O han sido sustituidas en gran medida por tinciones diferenciales más sensibles o técnicamente más fáciles de realizar, o por tinciones fluorescentes.

• Tinción de Gram: Una característica taxonómica importante de las bacterias es su respuesta a la tinción de Gram. Las propiedades de tinción de Gram parecen ser fundamentales, porque la reacción de Gram se correlaciona con muchas otras propiedades morfológicas en formas con relación filogenética. Un microorganismo que en potencia es positivo para la tinción de Gram puede parecerlo sólo bajo condiciones ambientales particulares y en un cultivo joven. Los procedimientos de tinción de Gram inician con la aplicación de un colorante básico, violeta de genciana (cristal violeta). A continuación se aplica una solución de yodo (lugol); todas las bacterias se tiñen de color azul en este punto del procedimiento. Luego la célula se trata con un decolorante (alcohol cetona). Las células grampositivas que conservan el complejo de violeta de genciana-yodo adquieren un color azul y las células gramnegativas se decoloran por completo con la adición de alcohol. Como último paso se aplica otro colorante (como rojo de safranina) de forma que las células gramnegativas decoloradas adquieran un color contrastante; las células grampositivas adquieren un color violáceo. La base de la reacción diferencial a la tinción de Gram es la estructura de la pared celular.

La tinción de Gram es el procedimiento más habitual de tinción en microbiología, y normalmente se usa como primer paso para la caracterización de bacterias recién aisladas. Si se dispone de un microscopio de fluorescencia, la tinción de Gram se puede reducir a un solo paso, porque las células grampositivas y las gramnegativas emiten fluorescencia de distinto color cuando se tratan con una sustancia especial.

Tinción de los flagelos: Los flagelos son demasiado delgados (12 a 30 nm de diámetro) para que sean visibles en el microscopio de luz. Sin embargo, su presencia y distribución pueden demostrarse al tratar las células con una suspensión coloidal inestable de sales de ácido tánico, lo que causa la precipitación intensa sobre las paredes celulares y flagelos. De esta manera, el diámetro aparente de éstos se incrementa a un tamaño tal que las tinciones subsiguientes con fucsina básica hacen visibles a los flagelos en la microscopia de luz. En las bacterias peritricas los flagelos forman haces durante el movimiento y tales haces pueden tener un grosor tal que sea posible observarlos en células vivas en la microscopia de campo oscuro o de contraste de fases.

Tinción de la cápsula: La presencia de la cápsula por lo común se demuestra por procedimientos de tinción negativa o modificaciones de tales procedimientos. Uno de estos métodos de “tinción de la cápsula” (método de Welch) implica el tratamiento con solución de violeta de genciana caliente seguido de un lavado con solución de sulfato de cobre. Este último se utiliza para eliminar el exceso de colorante porque las técnicas convencionales de lavado con agua causarían la disolución de la cápsula. Las sales de cobre también proporcionan color al fondo, con el resultado de que la célula y el fondo adquieren un color azul oscuro y la cápsula tiene un color azul mucho más pálido. Otra modificación de la  tinción negativa es el método de Maneval, que emplea rojo de congo y fucsina ácida. El espacio intercelular se tiñe de color oscuro y la célula bacteriana, de color rojo. Por contraste se observa la cápsula como un halo incoloro.

Tinción de nucleótidos: Los nucleótidos se pueden teñir con la tinción de Feulgen, un método específico para el DNA.

Tinción de esporas: Las esporas se observan de la manera más simple como cuerpos refringentes intracelulares en suspensiones celulares no teñidas o como áreas incoloras en células teñidas por métodos convencionales. La pared de la espora es relativamente impermeable, pero puede lograrse que el colorante penetre la espora mediante el calentamiento de la preparación. La misma impermeabilidad que sirve para evitar la decoloración de la espora después de un tratamiento con alcohol es suficiente para decolorar células vegetales. Más tarde puede aplicarse un segundo colorante. Las esporas a menudo se tiñen con verde de malaquita o carbolfucsina. Uno de los métodos mas conocidos para teñir esporas es la tinción de Wirtz. Esta tinción emplea como colorante principal el verde malaquita, que tiñe las esporas en caliente y como colorante de contraste a la safranina que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

Tinciones acidorresistentes: Se utilizan al menos tres tinciones acidorresistentes diferentes, cada una de las cuales aprovecha el hecho de que algunos microorganismos conservan una tinción principal incluso después de exponerlos a agentes decolorantes potentes, como mezclas de ácidos y alcoholes. El método de Ziehl-Neelsen es el más antiguo que se utiliza, aunque precisa el calentamiento de la muestra durante el procedimiento de tinción. Muchos laboratorios han sustituido este método por el de la tinción acidorresistente en frío (método de Kinyoun) o por la tinción fluorocrómica (método de auramina-rodamina). El método del fluorocromo es la tinción de elección porque se puede estudiar rápidamente una gran superficie de la muestra simplemente buscando microorganismos fluorescentes sobre un fondo negro. Algunos microorganismos son «parcialmente acidorresistentes», de manera que conservan la tinción principal sólo cuando se decoloran con una solución ácida débil. Esta propiedad es característica de tan sólo algunos microorganismos, lo que hace que sea bastante útil para su identificación preliminar.

Tinciones fluorescentes: La tinción acidorresistente de auramina-rodamina es un ejemplo específico de una tinción fluorescente. También se han utilizado otros muchos colorantes fluorescentes para teñir muestras. Por ejemplo, se puede utilizar la tinción de naranja de acridina para teñir bacterias y hongos, y el blanco de calcoflúor tiñe la quitina de las paredes de las células fúngicas. Aunque la tinción de naranja de acridina tiene unas aplicaciones bastante escasas, la tinción de blanco de calcoflúor ha sustituido a las tinciones de hidróxido potásico. Otro procedimiento es el estudio de muestras con anticuerpos específicos marcados con colorantes fluorescentes (tinciones con anticuerpos fluorescentes). La presencia de microorganismos fluorescentes es un método rápido tanto para la detección como para la identificación del microorganismo.